澳门新浦新京8466

加入收藏 | 设为澳门新浦新京8466 |      中文 | English

咨询热线: 028-85121781

当前位置:澳门新浦新京8466 > 动态中心 > 企业动态 澳门新浦新京8466通过调节人体真皮成纤维细胞胶原的代谢和凋亡以预防UVA诱导下的皮肤老化
澳门新浦新京8466通过调节人体真皮成纤维细胞胶原的代谢和凋亡以预防UVA诱导下的皮肤老化
[ 来源:国际分子科学杂志   发布日期:2022-08-02 16:11:30  责任编辑:  浏览次 ]

·         国际分子科学 

·         第23(13)节;2022 7月 

·         PMC9266774

国际分子科学杂志. 2022 7月;23(13): 6941.2022 年 6 月 22 日在线发布。

澳门新浦新京8466通过调节人真皮成纤维细胞中的胶原蛋白代谢和细胞凋亡来防止UVA诱导的皮肤光老化

薛妮娜, 刘颖, 金晶, 纪明和 陈晓光*神田直子, 学术编辑编辑信息 文章注释 版权和许可信息 免責聲明

关联数据

·         补充材料

·         数据可用性声明

转到:

抽象

皮肤老化分为受内在和外在因素影响的按时间顺序老化和光老化。本研究旨在探讨澳门新浦新京8466(CGA)对人真皮成纤维细胞(HDFs)的抗衰老能力及其机制。在这项研究中,CGA特异性地上调胶原蛋白I(Col1)mRNA和蛋白质表达,并在不影响细胞活力的情况下增加HDF上清液中的胶原蛋白分泌,后者在BioMAP HDF3CGF系统中也得到了证实。在紫外线A(UVA)诱导的光老化下,CGA通过增加UVA照射HDF中Col1表达和降低基质金属蛋白酶1(MMP1)和MMP3水平来调节胶原蛋白代谢。转化生长因子β(TGF-β)介导的Smad2/3分子的激活,这对Col1合成至关重要, 被UVA照射抑制,但在CGA存在下增强。此外,CGA减少了UVA诱导的活性氧(ROS)的积累,减弱了DNA损伤并促进细胞修复,从而降低了UVA照射HDF的细胞凋亡。总之,大家的研究首次证明了CGA在皮肤光老化过程中具有保护作用,特别是由UVA照射触发,并为进一步研究CGA用于预防或治疗皮肤老化提供了依据。 证明CGA在皮肤光老化过程中具有保护作用,特别是由UVA照射触发,并为CGA用于预防或治疗皮肤老化的进一步研究提供了依据。 证明CGA在皮肤光老化过程中具有保护作用,特别是由UVA照射触发,并为CGA用于预防或治疗皮肤老化的进一步研究提供了依据。

关键字: 胶原蛋白、基质金属蛋白酶、人真皮成纤维细胞、光老化、澳门新浦新京8466、UVA 辐射转到:

1. 概况

衰老是一个持续而缓慢的过程,会损害人类和动物不同器官和系统的形态和功能特征[1].皮肤老化只是这一过程的一个可见部分,其特征是由内在(例如,时间顺序、荷尔蒙和遗传)和外在环境压力因素引起的皱纹、松弛和色素不规则的出现。这些组织学变化通常与真皮中角质形成细胞和黑色素细胞过度增殖和胶原纤维降解有关[2,3].

皮肤由外表皮层和真皮内层组成,它们通过基底膜连接。I型胶原蛋白(Col1)是最丰富的真皮细胞外基质(ECM)成分,与胶原蛋白III(Col3)结合,在成人皮肤的真皮中形成广泛的细胞外纤维。Col1占85-90%,而Col3在人类成人皮肤中占8-11%,后者是新生儿皮肤中更重要的成分[4].Col1 随时间老化而降低,但可由光老化触发 [5].此外,Col1 可以通过水解蛋白质(例如基质金属蛋白酶 (MMP))来降解,这些蛋白质是降解 ECM 蛋白的普遍存在的内肽酶家族 [6].先前的研究表明,MMP-1,MMP-2和MMP-3主要是降解胶原蛋白和弹性蛋白的MMP[7].随着皮肤的老化过程,胶原蛋白的生物合成减少,胶原蛋白碎裂增加,这两者都有助于胶原蛋白含量的整体减少[8,9,10].因此,近年来,许多含有胶原蛋白的营养补充剂和特色食品已经上市,以促进皮肤的抗衰老。

天然产物或分子长期以来一直用于改善皮肤外观,例如熊果苷,森兰茂菌提取物,壬二酸,β-羟基酸,乳酸,洋甘菊提取物和鞣花酸[11].许多这些天然小分子或提取物表现出抗氧化活性,并在维持体内平衡和防止由于紫外线(UV)引起的皮肤损伤引起的光老化方面发挥作用。虽然这可以作为一般机制,但由于许多天然产物中的混合成分,难以识别更明确的分子介质。澳门新浦新京8466 (CGA) 是 L-奎宁酸和咖啡酸的酯,是一种天然产物,常见于人类饮食和由草药、水果和蔬菜制成的饮料中 [12].它已被证明具有多种生理特性,包括抗炎、抗氧化、免疫调节、抗菌和抗肿瘤作用[13,14,15,16].有一些研究报告了CGA的抗衰老作用。例如,Li等报道CGA可能通过抑制酪氨酸酶活性来抑制B16黑色素瘤细胞中的黑色素生成,暗示CGA对皮肤色素沉着的作用[17].Cha和Her等人表明,CGA可以防止UVB辐射引起的皮肤老化[18,19,20].这些报告与CGA对角质形成细胞,来自新生包皮或无毛小鼠的成纤维细胞中UVB诱导的光老化的保护作用有关,因为外在皮肤老化主要与太阳紫外线(UV)辐射暴露有关[21].然而,UVB主要导致表皮层的损伤。阳光中大约90-99%的长波紫外线(UVA)更深入地渗透到人体皮肤真皮组织中,因此UVA是皮肤光老化的主要因素[22].

在这方面,还没有研究显示CGA是否以及如何在正常和UVA诱导的光老化条件下保护人真皮成纤维细胞成体(HDF-α)细胞。本研究重点研究了CGA对HDFs的抗光老化作用,特别是在UVA辐照胁迫条件下以及与胶原蛋白代谢和细胞凋亡相关的机制。

转到:

2. 结果

2.1. CGA对人皮肤成纤维细胞胶原蛋白表达的影响

首先通过蛋白质印迹和定量RT-PCR(qRT-PCR)测定CGA对人皮肤成纤维细胞中胶原蛋白表达的影响。如 图1在0.1至3μM的较低浓度下使用的A,B,CGA增加了HDF-α和CCC-ESF-1细胞中的1型胶原蛋白(Col1)蛋白表达。CGA暴露48 h对Col1蛋白表达的刺激作用更为明显。为了检查CGA对胶原蛋白的刺激作用是否发生在转录水平上,检测了Col1(Col1A1,Col1A2)和Col3(Col3A1)mRNA表达的基因。如 图1浓度为0.3至10μM的C-E,CGA增强了Col1A1和Col1A2 mRNA水平,特别是在Col1A2 mRNA表达中。CGA(1,3和10μM)的存在显着增加了Col1A2 mRNA水平。然而,暴露CGA后Col3A1 mRNA水平几乎没有变化。这些数据表明CGA特异性诱导Col1表达;这一结果归因于Col1A2基因转录的促进。

图1

CGA对人皮肤成纤维细胞中胶原蛋白表达的影响。在HDF-α细胞中暴露CGA24或48小时后,通过蛋白质印迹测定法检测胶原蛋白I水平(一个) 和 CCC-ESF-1 细胞 (B).Col1A1 (C), Col1A2 (D) 和 Col3A1 (E)在HDF-α细胞中用CGA处理48小时后,通过qRT-PCR测定法测量mRNA水平。这些值表示为三个实验的平均值±SD。* p ≤ 0.05, ** p ≤0.01表示差异显著。

2.2. CGA对HDF中胶原蛋白分泌的影响

大家接下来专注于HDF-α细胞,将其暴露于指定剂量的CGA48小时,并通过Biocolor Sircol评估细胞培养上清液中总胶原蛋白的分泌量测定。暴露于CGA导致胶原蛋白分泌的显着诱导(图2同时,通过MTT测定法检测CGA对细胞活力的影响。 图2B显示,0.3至50μM之间的CGA剂量在处理24,48和72小时后几乎不影响HDF-α细胞的增殖。结果表明CGA促进了胶原蛋白的产生,而不影响HDF-α细胞的增殖。此外,在BioMAP HDF3CGF系统中,原发性人新生儿包皮成纤维细胞(HDF-n)在刺激前24小时接种在低血清条件下,细胞因子列于以下位置 表1 并用指定剂量的CGA再处理72小时。中描述的十六 (16) 个参数 表1 评估了CGA对HDF的影响。在这些读数中,组织重塑分子胶原蛋白I和炎症因子干扰素诱导的T细胞α化学引诱剂(I-TAC,也称为CXCL11)在该系统中用CGA治疗后变化最明显(图3A). 浓度为10和50μM的CGA使胶原蛋白I含量增加了约17%(图3B).

图2

CGA对HDF-α细胞胶原蛋白分泌的影响。(一个)在CGA暴露48小时后测量HDF-α细胞上清液中的可溶性总胶原蛋白含量。B)通过MTT测定检测用CGA处理24,48或72小时的HDF-α细胞的细胞活力抑制。这些值表示为三个实验的平均值±SD。** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001 表示存在显著差异。

图3

CGA对HDF中胶原蛋白I产生的影响。一个BioMAP HDF3CGF系统用于评估CGA对参与组织重塑和炎症的16种生物标志物(蛋白质)的影响。(B)用CGA处理后胶原蛋白I的相对增加百分比被量化并显示在直方图中。

表1

筛选研究中使用的BioMAP HDF3CGF系统。显示的细胞类型在CGA存在下用环境因子培养和刺激72小时。测量了列出的生物标志物读数。

系统

细胞类型

环境

读数

HDF3CGF

真皮成纤维细胞

IL-1β + TNF-α + IFNγ+
  bFGF + EGF + PDGF-BB

MCP-1, VCAM-1, ICAM-1, 胶原蛋白 I., 胶原蛋白 III., IP-10, I-TAC, IL-8, MIG, EGFR, M-CSF, MMP-1,   PAI-1, 增殖-72 小时, SRB, TIMP-1, TIMP-2

在单独的窗口中打开

2.3. CGA 对 UVA 照射 HDF 中胶原蛋白代谢的影响

皮肤光老化通常与紫外线照射有关。基于大家对非胁迫条件下HDFs的研究,大家进一步研究了CGA对UVA照射引发的皮肤光老化的作用。特别是,大家测量了胶原蛋白的转录合成和降解代谢。首先,大家检测了UVA照射的HDF-α细胞中参与不同胶原蛋白合成亚群的关键基因的mRNA水平。 图4A-D显示,UVA照射后I型胶原蛋白(Col1A1),III型胶原蛋白(Col3A1)和V型胶原蛋白(Col5A1)基因水平均显着下调。在CGA(3和30μM)存在下,UVA照射的HDF-α细胞中的Col 1A1基因表达显着增加(p ≤ 0.01; p ≤0.05),但CGA对Col3A1或Col5A1 mRNA水平的影响很小。大家还研究了CGA对MMP表达的影响,如MMP1,MMP3和MMP9,它们参与胶原蛋白的分解。与胶原蛋白相反,UVA照射显着增加了MMP1和MMP3的mRNA表达(p ≤ 0.01; p ≤ 0.05; 图4E,F)。然而,与单独的UVA照射相比,CGA加UVA照射的联合治疗导致HDF-α细胞中MMP1和MMP3转录表达降低。在UVA照射的HDF-α细胞中,MMP3 mRNA水平显着降低了3和30 μM CGA(p ≤ 0.01; p ≤0.01)。

图4

CGA对UVA照射的HDF-α细胞中胶原蛋白I代谢的影响。Col1A1(一个), Col1A2 (B), Col3A1 (C), Col5A1 (D)、MMP1 (E) 和 MMP3 (F)在UVA照射的HDF-α细胞中通过qRT-PCR检测。数据表示三个独立测量的平均±SD。* p ≤ 0.05, ** p ≤0.01表示差异显著。(G) 通过蛋白质印迹法测定UVA照射的HDF-α细胞中的Col1、MMP3和纤连蛋白表达。(H)通过密度测定法定量相对蛋白质表达,并在直方图中显示。结果代表三个独立实验的平均值。* p ≤0.05表示差异显著。

此外,大家还分析了CGA对Col1和MMP3(图4G,H)。与mRNA数据一致,UVA照射显着降低了Col1蛋白,但HDF-α细胞中的CGA处理挽救了这种减少。相比之下,MMP3蛋白在紫外线照射后略有增加,但与CGA组合后下调。另一种ECM蛋白纤连蛋白的水平在UVA照射后或在HDF-α细胞中存在CGA的情况下显示出与Col1相似的趋势。

2.4. CGA 对 UVA 辐照 HDF 中 TGF-β/Smad 信号传导的影响

探索CGA诱导的UVA照射HDF中胶原蛋白生成的潜在机制,Smad2 / 3和ERK1 / 2分子的活化,这是胶原蛋白合成的两个关键信号通路[23,24],通过蛋白质印迹法进行分析。暴露于UVA辐射后,HDF-α细胞中的Smad2/3磷酸化水平降低。与仅UVA照射的HDF-α细胞相比,UVA照射和CGA联合处理增加了磷酸化的Smad2 / 3表达。然而,暴露于UVA或与CGA组合后磷酸化ERK1 / 2的水平保持不变(图5答,B)。

图5

CGA对UVA照射HDF-α细胞中Smad2/3和ERK1/2信号通路的影响。(一个) 通过蛋白质印迹法测定UVA照射的HDF-α细胞中的p-Smad2/3、Smad2/3、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表达。(B)通过密度测定法定量相对蛋白质表达,并在直方图中显示。数据表示为三个实验的平均值。* p ≤0.05表示差异显著。

2.5. CGA 可防止 UVA 诱导的 HDF 细胞凋亡

紫外线照射可能引起细胞杀伤。流式细胞术分析显示,与未照射的HDF-α细胞(p ≤ 0.05; p ≤ 0.05) (图6答,B)。用CGA(3和30μM)处理显着降低了这两种细胞的比例。例如,HDF-α细胞中晚期细胞凋亡细胞的百分比从UVA照射组的18.4%降低到30μMCGA处理组的1.8%(p ≤0.05)。因此,在UVA照射后,裂解-PARP的表达(细胞凋亡的关键指标)显着增加,HDF-α细胞中CGA处理以剂量依赖性方式降低(图6E,F)。

图6

CGA对UVA照射HDF-α细胞细胞凋亡和ROS产生的影响。用UVA照射HDF-α细胞60分钟,然后用CGA处理24小时,收获用于细胞凋亡和ROS分析。(一个)细胞凋亡的百分比通过膜联蛋白V-FTC/PI双染色测定法测定,然后进行流式细胞术测定。(B)对各种治疗组中的活细胞、早期和晚期凋亡细胞以及坏死细胞进行统计分析。数据表示为三个实验的平均值。(C)使用DCFH-DA探针通过流式细胞术测定评估ROS的产生。(DROS平均荧光强度(MFI)是从三个实验中计算出来的,并在直方图中显示。* p ≤ 0.05, ** p ≤0.01表示差异显著。(E) 裂解的 PARP 的蛋白质表达,γ-H2UVA照射HDF-α细胞中的AX和Rad51是使用特异性抗体通过蛋白质印迹测定法测定的。(F)通过密度测定法定量相对蛋白质表达,并在直方图中显示。数据表示为三个实验的平均值。* p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.001 表示存在显著差异。

2.6. CGA 抑制 UVA 诱导的 ROS 在 HDF 中产生

为了进一步了解CGA如何抑制紫外线照射诱导细胞凋亡,大家测量了ROS的产生。如 图6与对照组相比,C,D,UVA照射60 min导致ROS水平显着升高(p <0.01)。然而,CGA(30μM)联合处理显着降低了UVA照射的HDF-α细胞中细胞ROS的积累(p <0.05)。γ-H 的水平2AX是双链断裂(DSB)最敏感的标志物,在UVA照射后也显着增加(图6然而,CGA与UVA照射相结合明显抑制了γ-H。2HDF-α细胞中的AX表达。用于DNA修复的替代生物标志物Rad51,在UVA暴露后上调,并在CGA处理后进一步增加(图6E).

转到:

3. 讨论

大家的研究首次表明,CGA治疗通过上调Col1 mRNA和蛋白质水平,增加了HDF中的胶原蛋白生物合成和分泌,特别是在1型胶原蛋白中。MMP1和MMP3在HDF-α细胞中mRNA水平比MMP9高表达,分析表明CGA不影响正常HDF-α细胞中MMP1和MMP3 mRNA表达(补充图 S1A,B).这些数据表明,CGA主要促进Col1生物合成,而不是抑制其在非胁迫HDF中的降解。

阳光中的紫外线辐射被认为是导致皮肤外在老化的最突出的物理因素。慢性UVA辐射导致光敏性,光老化和恶性皮肤肿瘤的发展[25].更重要的是,与之前的报告一致[26],大家发现UVA照射通过下调Col1,Col3和Col5基因水平显着降低胶原蛋白的产生,并通过上调MMP1和MMP3 mRNA水平刺激胶原蛋白降解。与CGA联合使用显着逆转了UVA照射的HDF-α细胞中Col1和MMP3的表达,从而通过增强Col1的产生和抑制其降解来改善皮肤光老化。纤连蛋白是皮肤的另一个重要成分,它沿着真皮 - 表皮交界处离散沉积。CGA减弱了暴露于UVA后纤连蛋白的减少,表明CGA促进了其他ECM产物的合成。

许多促纤维化生长因子和细胞因子如TGF-β、IL-4和IL-13可能与成纤维细胞的细胞膜受体结合并介导Col1生物合成。TGF-β是其中的主要激活剂,它诱导Smad 2/3与Smad 4形成异二聚体复合物,然后将这种三级复合物易位到细胞核中以激活原胶原启动子[27].UVA照射可以减少TGF-β I和TGF-β II受体的合成,从而抑制TGF-β/smad途径[23].正如预期的那样,UVA照射抑制了HDF中Smad 2/3信号分子的活化。 CGA显着增加了UVA照射HDF中磷酸化的Smad 2/3表达。 此外,即使ERK途径是一种重要的MAPK信号通路,其建立是为了参与Col1转录的激活[24],大家的研究表明,p-ERK1/2在单独UVA辐射或与HDF中的CGA组合中几乎没有变化。这些结果表明,CGA通过刺激UVA照射HDF中的TGF-β-Smad2/3信号通路来促进Col1表达。

已经确定,紫外线辐射通过表皮或真皮中产生的活性氧(ROS)引起显着的氧化应激。ROS的积累增加了MMP活性,导致细胞外基质(ECM)通过胶原降解破坏[28],但也唤起DNA损伤和细胞凋亡。因此,化妆品中的天然植物化学物质,尤其是抗氧化剂正在稳步增加,以防止太阳紫外线引起的对人体皮肤的氧化损伤。例如,姜黄素对UVB或UVA诱导的ROS产生产生抑制作用,并通过上调HDF中的BCL2蛋白来防止UVA介导的细胞凋亡[29,30].在大家的研究中,CGA显着降低了γ-H2AX水平进一步促进了UVA照射HDFs中Rad51的表达,表明CGA处理后DNA DSBs损伤和修复功能的改善与细胞ROS产生的减少同时发生,导致UVA照射HDFs对细胞凋亡和坏死细胞的抑制。

虽然CGA减毒UVA照射HDF-α细胞凋亡或坏死的这一发现似乎与其在中国实体瘤1期研究中证明的抗癌疗法的作用背道而驰(http://www.chinadrugtrials.org.cn (2022 年 1 月 31 日访问),编号 CTR20160113,以及美国临床试验标识符 http://clinicaltrials.gov (于2022年1月31日访问), NCT02728349),一致的是CGA本身不是直接的细胞凋亡诱导剂,也不能抑制HDF-α细胞中的增殖,如本研究所示。UVA照射可能会触发HDF-α细胞中与其他癌细胞不同的信号通路。通过调节免疫反应,例如胶质母细胞瘤中的M2复极化为M1,它引发抗肿瘤活性[15].有趣的是,在光老化的背景下,对于上述1期试验中的胶质母细胞瘤患者,大家观察到一些患者的皮肤变得美白和明亮,主要是面部皮肤。CGA治疗GBM患者血清中Col1含量的分析显示,CGA治疗后Col1含量逐渐升高(补充图S2),就像大家在 HDF 模型中发现的 Col1 增加的 CGA 一样。目前尚不清楚用CGA治疗的胶质母细胞瘤患者中Col1的这种增加是直接的或反馈保护作用。然而,Col1产生对肿瘤血管生成和脑肿瘤进展的影响需要在进一步的研究中阐明。

综上所述,CGA促进了在未辐照HDFs下Col1的合成。此外,CGA通过抑制胶原蛋白降解和增强胶原蛋白合成来保护HDF-α细胞免受UVA诱导的光老化。此外,CGA减少了UVA诱导的ROS的积累,减轻了DNA损伤并促进了细胞修复。CGA对UVA诱导的光老化进行光保护的潜在机制显示在 图7.综上所述,这些发现支撑进一步研究CGA是预防或治疗皮肤光老化和时间老化的有效治疗剂。

图7

CGA在HDF-α细胞上的光保护示意图。CGA通过TGF-β-Smad2/3信号传导促进胶原蛋白1的合成,并通过下调MMP-1和MMP-3抑制胶原蛋白降解。此外,CGA减少了UVA诱导的ROS的积累,减弱了DNA损伤并促进细胞修复,从而抑制了细胞凋亡。绿色虚线T条,潜在抑制;直箭头,激活;虚线箭头,潜在激活。ECM,细胞外基质;MMP,基质金属蛋白酶;活性氧,活性氧。

转到:

4. 材料和方法

4.1. 细胞培养

人胚胎皮肤成纤维细胞CCC-ESF-1细胞由中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心(中国北京协和医学院)提供。原代人真皮成纤维细胞-成人(HDF-α)细胞购自ScienCell研究图书馆(美国加利福尼亚州圣地亚哥)。CCC-ESF-1细胞在Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM,Gibco)中培养&reg;, 生命科技,加利福尼亚州卡尔斯巴德,美国),补充有 10% 胎牛血清 (FBS)(Gibco,赛默飞世尔科技,美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)和 100 单位/mL 青霉素和 100 单位/mL 链霉素。将HDF-α细胞在成纤维细胞培养基(FM,ScienCell Research Laboratories,Inc.,加利福尼亚州圣地亚哥,美国,Cat. #2301)中与2%FBS,成纤维细胞生长补充剂(FGS,ScienCell Research Laboratories,Inc.,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国,猫#2352)和青霉素/链霉素溶液一起孵育。将这些细胞在5%CO的潮湿气氛中孵育2 在37°C。

4.2. UVA 照射

HDF-α细胞以2.5×10的密度接种5/6孔培养板的孔。24小时后,用PBS替换培养基并暴露于UVA(12J / cm2) 60 分钟。实验中使用的UVA源是紫外光疗仪器(PURI Materials,中国深圳),其峰值发射波长为365 nm。UVA暴露后,用PBS洗涤细胞,然后用DMSO(0.1%,对照)或CGA(3,30μM)孵育24小时以进一步实验。

4.3. 抗体和化学品

从 abcam 获得针对胶原 1 和纤连蛋白的抗体。MMP3, 裂解帕普, Rad51, γ-H2AX, p-ERK1/2泰尔202/泰尔204、ERK、p-smad2/3、smad2/3、β-肌动蛋白和相应的HRP关节二抗购自Cell Signaling Technologies(美国马萨诸塞州丹弗斯)。MTT和DCFH-DA购自Solarbio(中国上海)。澳门新浦新京8466(CGA)由澳门新浦新京8466(中国成都)提供,并以适当的浓度溶解在DMSO中。

4.4. 细胞活力测定

MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)测定适用于测量CGA对体外人真皮成纤维细胞的毒性作用。将HDF-α细胞接种到96孔板中。过夜后,将细胞在37°C下用不同浓度的CGA处理24,48和72小时。 然后,将MTT(终浓度,0.5mg / mL)溶液孵育4小时。随后,除去培养基并将甲臜晶体溶解在DMSO中。酶标仪(Biotek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)用于测定570nm处的吸光度。

4.5. 定量 RT-PCR (qRT-PCR) 测定

HDF-α细胞的总RNA通过Easypure RNA试剂盒(Tansgen Biotech,中国北京)提取。cDNA 是按照制造商的说明使用 TransScript 一步法 gDNA 去除和 cDNA 合成 SuperMix 试剂盒(中国北京坦斯根)获得的。使用SYBR绿色PCR预混液试剂盒(Cat.QPK-201,日本东洋纺)和ABI PRISM 7900序列检测系统(应用生物系统,美国加利福尼亚州福斯特城)。用于qPCR的引物如下: 表2.GAPDH被用作内部控制。指示的基因表达根据 2−ΔΔCt 方法。

表2

qRT-PCR实验中的引物序列。

目标

引物序列 (5′-3′)

hCol1A1-F

GTGCGATGACGTGATCTGTGA

hCol1A1-R

CGGTGGTTTCTTGGTTGGT

hCol1A2-F

GGCCCTCAAGGTTTCCAAGG

hCol1A2-R

CACCCTGTGGTCCAACAACTC

hCol3A1-F

TTGAAGGAGGATGTTCCCATCT

hCol3A1-R

ACAGACACATATTTGGCATGGTT

hCol5A1-F

TACCCTGCGTCTGCATTTCC

hCol5A1-R

GCTCGTTGTAGATGGAGACCA

hMMP1-F

AAAATTACACGCCAGATTTGCC

hMMP1-R

GGTGTGACATTACTCCAGAGTTG

hMMP3-F

CTGGACTCCGACACTCTGGA

hMMP3-R

CAGGAAAGGTTCTGAAGTGACC

hMMP9-F

TGTACCGCTATGGTTACACTCG

hMMP9-R

GGCAGGGACAGTTGCTTCT

hGAPDH-F

GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT

hGAPDH-R

GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG

4.6. 蛋白质印迹测定

CGA处理的HDF-α细胞用冰冷的RIPA裂解缓冲液裂解30分钟。通过SDS-PAGE对来自上清液的等量蛋白质进行,将蛋白质转移到PVDF膜上(密理博,伯灵顿,马萨诸塞州,美国)。用5%BSA封闭后,用特异性一抗探测膜,并用相应的HRP偶联二抗进一步处理。然后用Tanon Chemishinecence Substrates可视化蛋白质,由Image Quant LAS 4000(GE Healthcare,皮斯卡塔韦,新泽西州,美国)记录,并用Image JApp进行分析。

4.7. 可溶性胶原蛋白检测

将HDF-α细胞以1×10的密度接种在24孔板中5 细胞/井。用或不结合不同浓度的CGA处理细胞。48小时后,收集上清液,并使用SirCol胶原蛋白测定法(Biocolor,贝尔法斯特,爱尔兰)定量总可溶性胶原蛋白。对于这些实验,将从处理过的细胞中提取的 100 μL 上清液与 1 mL 天狼星红染料(一种阴离子染料,在测定条件下与碱性侧链胶原蛋白基团发生特异性反应,然后在室温下轻轻旋转孵育 30 分钟。以 12,000 rpm 离心 10 分钟后,加入 750 μL 冰冷的酸盐洗涤试剂以除去未结合的染料。随后,用250μL碱试剂重新溶解胶原蛋白结合的染料,并根据制造商的说明在555nm处测量吸光度(Biotek仪器企业,美国)。 使用测定中提供的I型胶原蛋白校准标准品获得标准曲线。

4.8. 生物地图分析分析

本研究使用了八个BioMAP系统,以快速表征CGA功能。在BioMAP HDF3CGF系统中,原发性人新生儿包皮成纤维细胞(HDF-n)在低血清条件下接种24小时,然后用细胞因子刺激 表1 用指定剂量的CGA孵育72小时后,一组生物标志物(蛋白质)读数在 表1 由ELISA测量。本研究中使用的方法与前面描述的方法基本相同[31].

4.9. 细胞凋亡测定

HDF-α细胞在UVA照射(12 J / cm)后用CGA处理2).孵育24小时后,收获HDF-α细胞并重悬于100μL染色缓冲液中。然后,加入 5 μL 膜联蛋白 V-APC 和 10 μL 碘化丙啶 (PI) 并在黑暗中孵育 5 分钟。使用流式细胞术(BD FACSVerse)分析早期和晚期细胞凋亡细胞和坏死细胞,BD生物科学,美国加利福尼亚州圣何塞)。

4.10.细胞 ROS 检测测定

将HDF-α细胞以3×10的密度接种在6孔板中5 细胞/井。在UVA照射(12J / cm)后马上用或没有CGA(终浓度为3和30μM)处理细胞2).孵育24小时后,收集HDF-α细胞,并根据制造商的说明使用DCFH-DA ROS探针使用活性氧测定试剂盒(Solarbio,CA1410,中国上海)测定细胞内ROS的产生。将HDF-α细胞在37°C下用5%CO染色10μM DCFH-DA工作缓冲液染色30分钟。2.然后,收获细胞并使用BD FACSVerse进行分析流式细胞术。

4.11. 统计分析

数据表示为使用一式三份值±标准差 (S.D) 的均值。比较使用双尾学生的 t-测试。差异被认为在 p ≤0.05。

转到:

确认

编辑感谢首都医科大学北京天坛医院胶质瘤科李文斌和四川澳门新浦新京8466科技发展有限企业邓静、张杰的支撑。

转到:

缩写

中广机构

澳门新浦新京8466

高密度纤维板

人真皮成纤维细胞

白菜

胶原

DSB

双股断裂

微型企业

基质金属蛋白酶

企业内容管理

细胞外基质

葡萄

紫外线 A

赞美

活性氧

TGF-β

转化增长因子β

转到:

补充材料

以下内容可在线获取 https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23136941/s1.

单击此处获取其他数据文件。(231K,压缩)转到:

资助声明

本研究由中国国家自然科学基金(81703566)资助。

转到:

编辑贡献

概念化和方法论,N.X.和Y.L.;正式分析和数据管理,J.J.和M.J.;写作——原始草稿准备,新泽西州;监督和项目管理,X.C.所有编辑均已阅读并同意已发表的手稿版本。

转到:

机构审查委员会声明

不適用。

转到:

知情同意声明

不適用。

转到:

数据可用性声明

数据包含在文章中。

转到:

利益冲突

编辑声明不存在利益冲突。

转到:

脚注

发布者注: MDPI对已发布地图和机构隶属关系中的管辖权主张保持中立。

转到:

引用

1. 罗斯 M.R., 弗拉特 T., 格雷夫斯 J.L., 格里尔 L.F., 马丁内斯 D.E., 马托斯 M., 穆勒 L.D., 雷斯 R.J.S., 沙赫雷斯塔尼 P.什么是衰老? 前面。热内。 2012;3:134. DOI: 10.3389/fgene.2012.00134. [PMC 免费文章] [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]2. Brenneisen P.,Sies H.,Scharffetter-Kochanek K.紫外线-B辐照和基质金属蛋白酶 - 从通过信号诱导到初始事件。 安. N. Y. 阿卡德科学. 2002;973:31–43.DOI:10.1111/j.1749-6632.2002.tb04602.x。 [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]3. Hirobe T.,Osawa M.,Nishikawa S.I.钢因子控制培养中新生小鼠表皮黑色素细胞的增殖和分化。 颜料。细胞分辨率 2003;16:644–655.DOI:10.1046/j.1600-0749.2003.00092.x。 [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]4. Smith L.T.,Holbrook K.A.,Madri J.A.人类胚胎和胎儿皮肤中的I,III和V型胶原蛋白。 阿纳特。 1986;175:507–521.DOI:10.1002/aja.1001750409。 [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]5. Rittie L.,Fisher G.J.自然和阳光引起的人体皮肤老化。 冷泉哈尔布。透视。地中海。 2015;5:a015370.DOI:10.1101/cshperspect.a015370。 [PMC 免费文章] [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]6. Verma R.P.,Hansch C.基质金属蛋白酶(MMPs):化学生物学功能和(Q)SARs。 生物有机医学化学 2007;15:2223–2268.DOI: 10.1016/j.bmc.2007.01.011. [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]7. 埃尔曼 H., 格利斯根 R., 坚吉兹 M., 塔巴克 O., 额尔德宁 F., 乌尊 H.血管内皮生长因子,金属蛋白酶及其组织抑制剂与代谢综合征心血管危险因素的关联。 欧洲修订版医学药理学。科学. 2016;20:1015–1022. [公共医学] [GOOGLE学术搜索]8. Kohl E., Steinbauer J., Landthaler M., Szeimies R.M. 皮肤老化。 J. Eur. Acad. Dermatol.维尼罗。 2011;25:873–884.DOI:10.1111/j.1468-3083.2010.03963.x. [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]9. Varani J., Dame M.K., Rittie L., Fligiel S.E., Kang S., Fisher G.J., Voorhees J.J. 按时间顺序老化的皮肤中胶原蛋白生成减少:成纤维细胞功能年龄依赖性改变和机械刺激缺陷的作用。 帕托尔。 2006;168:1861–1868.DOI:10.2353/ajpath.2006.051302。 [PMC 免费文章] [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]10. Quan T., Qin Z., Xia W., Shao Y., Voorhees J.J., Fisher G.J. 光老化中的基质降解金属蛋白酶。 J. 调查。皮肤托。交响。 2009;14:20–24.DOI: 10.1038/jidsymp.2009.8. [PMC 免费文章] [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]11. Zaid A.N.,Al Ramahi R.天然分子的色素脱斑和抗衰老治疗。 库尔。药剂师 2019;25:2292–2312.DOI:10.2174/1381612825666190703153730。 [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]12. Clifford M.N. 澳门新浦新京8466和其他肉桂酸盐 - 性质,发生和饮食负担。 J. 科学. 食品农业 1999;79:362–372.doi: 10.1002/(SICI)1097-0010(19990301)79:3<362::AID-JSFA256>3.0.CO;2-D. [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]13. 徐永霞, 陈建华, 于晓军, 陶文伟, 姜福瑞, 尹志明, 刘春. 澳门新浦新京8466对小鼠脂多糖诱导急性肝毒性的保护作用. 易燃。Res. 2010;59:871–877.DOI:10.1007/s00011-010-0199-z。 [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]24米 吴敏, 何军, 任晓, 蔡文生, 方玉春, 冯晓忠. 聚二甲基硅氧烷与生物活性澳门新浦新京8466表面改性开发功能生物界面. 胶体冲浪。B. 2014;116:700–706.DOI: 10.1016/j.colsurfb.2013.11.010. [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]15. 薛旷, 周琪, 季敏, 金军, 赖芳, 陈军, 张敏, 贾军, 杨华, 张军, 等.澳门新浦新京8466通过将巨噬细胞从 M2 复极化到 M1 表型来抑制胶质母细胞瘤的生长。 科学代表 2017;7:39011. DOI: 10.1038/srep39011. [PMC 免费文章] [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]16. 纳韦德 M., 赫贾齐 V., 阿巴斯 M., 坎博 A.A., 汗 G.J., 舒姆扎伊德 M., 艾哈迈德 F., 巴巴扎德 D., 夏 F.F., 莫达雷西-加扎尼 F., 等澳门新浦新京8466(CGA):药理学审查并呼吁进一步研究。 生物医学。药理剂。 2018;97:67–74.DOI: 10.1016/j.biopha.2017.10.064. [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]17. Li H.R., Habasi M., Xie L.Z., Aisa H.A. 澳门新浦新京8466对B16黑色素瘤细胞黑色素生成的影响. 分子。 2014;19:12940–12948.DOI:10.3390/分子190912940。 [PMC 免费文章] [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]18. 车建华, 朴明杰, 金国昌, 姚志伟, 郑建, 金世明, 玄志林, 安永祥, 玄俊华多酚澳门新浦新京8466可减弱人HaCaT角质形成细胞中UVB介导的氧化应激。 生物摩尔。瑟。 2014;22:136–142.DOI: 10.4062/biomolther.2014.006. [PMC 免费文章] [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]19. 她的Y., Lee T.K., Kim J.D., Kim B., Sim H., Lee J.C., Ahn J.H., Park J.H., Lee J.W., Hong J., et al. 富含澳门新浦新京8466和芦丁的野樱桃黑果提取物的局部应用通过减弱小鼠胶原蛋白破坏来减少UVB诱导的皮肤损伤。 分子。 2020;25:4577. DOI: 10.3390/分子25194577. [PMC 免费文章] [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]20. Girsang E.,Ginting C.N.,Lister I.N.E.,Gunawan K.Y.,Widowati W.澳门新浦新京8466对紫外线诱导的成纤维细胞的抗炎和抗衰老特性。 佩尔· 2021;9:e11419.DOI:10.7717/peerj.11419。 [PMC 免费文章] [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]11米 Chung J.H., Seo J.Y., Lee M.K., Eun H.C., Lee J.H., Kang S., Fisher G.J., Voorhees J.J. 人巨噬细胞金属弹性蛋白酶在人体皮肤中的紫外线调节 在体内。 J. 调查。皮肤托。 2002;119:507–512.DOI:10.1046/j.1523-1747.2002.01844.x。 [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]22. 罗塞蒂 D., 基尔曼诺维奇 M.G., 维戈德曼 S., 胡永平, 陈 N., 恩肯内 A., 奥多斯 T., 菲舍尔 D., 塞贝格 M., 林 C.B.视黄醇的新型抗衰老机制:诱导真皮弹性蛋白合成和弹性蛋白纤维形成。 国际 J. 科斯梅特。科学. 2011;33:62–69.DOI: 10.1111/j.1468-2494.2010.00588.x. [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]23. Purohit T.,He T.,Qin Z.,Li T.,Fisher G.J.,Yan Y.,Voorhees J.J.,Quan T.人真皮成纤维细胞中I型胶原蛋白的Smad3依赖性调节:对人体皮肤结缔组织衰老的影响。 J.德马托尔。科学. 2016;83:80–83.DOI: 10.1016/j.jdermsci.2016.04.004. [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]14米 Bhogal R.K.,Bona C.A.细胞外信号调节激酶(ERK)对IL-4和IL-13刺激的人真皮成纤维细胞中I型胶原合成的调节作用。 国际修订版免疫学。 2008;27:472–496.DOI:10.1080/08830180802430974。 [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]25. Gonzaga E.R. 紫外线在光损伤、皮肤老化和皮肤癌中的作用:光保护的重要性。 克林。皮肤托。 2009;10(增刊1):19–24.DOI:10.2165/0128071-200910001-00004。 [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]26. Landau M. 皮肤老化的外源性因素。 库尔。大概。皮肤托。 2007;35:1–13. [公共医学] [GOOGLE学术搜索]27. Inagaki Y.,Truter S.,Ramirez F.转化生长因子-β通过含有Sp1结合位点的顺式作用元件刺激α 2(I)胶原蛋白基因表达。 J. 生物化学 1994;269:14828–14834.DOI:10.1016/S0021-9258(17)36699-1。 [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]28. Choi S.I., Jung T.D., Cho B.Y., Choi S.H., Sim W.S., Han X., Lee S.J., Kim Y.C., Lee O.H. 发酵农副产品对紫外线的抗光老化作用 Birradi 无毛小鼠皮肤. 国际 J. 摩尔医学 2019;44:559–568. [PMC 免费文章] [公共医学] [GOOGLE学术搜索]29. 刘 X., 张 R., 施 H., 李 X., 李 Y., 塔哈 A., 徐 C. 姜黄素对紫外线 A 照射诱导的人真皮成纤维细胞光老化的保护作用. 摩尔医学代表 2018;17:7227–7237. [PMC 免费文章] [公共医学] [GOOGLE学术搜索]30. Hwang B.M., Noh E.M., Kim J.S., Kim J.M., You Y.O., Hwang J.K., Kwon K.B., Lee Y.R. 姜黄素通过抑制人真皮成纤维细胞中的 MAPK-p38/JNK 途径来抑制 UVB 诱导的基质金属蛋白酶-1/3 表达。 Exp. Dermatol. 2013;22:371–374.DOI:10.1111/exd.12137。 [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]31. Berg E.L.,Yang J.,Melrose J.,Nguyen D.,Privat S.,Rosler E.,Kunkel E.J.,Ekins S.在原代人类细胞系统中定义的化学靶标和途径毒性机制。 药理学杂志。毒理学。方法。 2010;61:3–15.DOI: 10.1016/j.vascn.2009.10.001. [公共医学] [交叉引用] [GOOGLE学术搜索]





 

文章来自 国际分子科学杂志 此处提供 多学科数字出版学院 (MDPI)


上一篇:澳门新浦新京8466通过ACAT1-TPK1-PDH途径诱导神经母细胞瘤细胞分化
下一篇:我企业参加第六届中国创投大会并发布Ⅱ期临床试验结果
【相关资讯】
·澳门新浦新京8466通过ACAT1-TPK1-PDH途径诱导神经母细胞瘤细胞分化 2023-08-22
·澳门新浦新京8466通过调节人体真皮成纤维细胞胶原的代谢和凋亡以预防UVA诱导下的皮肤老化 2022-08-02
·我企业参加第六届中国创投大会并发布Ⅱ期临床试验结果 2021-09-29
·来自临床试验的一线报道:“R病房”的患者和医生 2021-04-30
·澳门新浦新京8466的药理作用及机制研究进展 2020-05-26
·澳门新浦新京8466抗病毒文献概况 2020-03-09
·我企业参加第四届中国创投大会路演并取得圆满成功 2019-09-24
·澳门新浦新京8466II期临床试验已获得北京协和医院等多家中心的伦理批件 2019-08-12
XML 地图 | Sitemap 地图